近日，国际学术期刊PLoS Pathogens发表山东中医药大学中药抗病毒青创团队关于流感小鼠活体成像模型的研究工作，题为“Expanding the Tolerance of Segmented Influenza A Virus Genome Using a Balance Compensation Strategy”。

病毒感染动物活体成像模型能够连续实时观察病毒在动物体内复制动态，对于病毒复制、进化、致病机制等相关基础研究以及抗病毒药物和疫苗研发均具有重要价值。稳定携带荧光蛋白/荧光素酶等报告基因的重组病毒是构建病毒感染动物活体成像模型的基础。甲型流感病毒（Influenza A virus，IAV）由于分节段基因组的复杂特点，其任意节段容纳外源能力有限，一定程度限制了流感报告病毒的开发。

前期，山东中医药大学中药抗病毒青创团队深入探索了IAV基因组低外源容纳的分子机制，发现外源基因插入容易导致目标修饰节段复制能力降低，从而破坏多节段基因组的平衡，进而影响后续相关病毒蛋白表达及子代病毒的包装等过程（例如，产生大量外源修饰目的节段缺损的干扰病毒颗粒），导致重组病毒复制能力和毒力下降、外源基因不稳定易丢失（Zhao et al., Viruses, 2018）。

基于这一发现，该团队开发了一种“平衡补偿”的重组IAV构建策略，通过在外源修饰目的节段引入额外的复制增强突变，以补偿外源修饰目的节段的复制能力，从而实现重组IAV多节段基因组的再平衡。为了验证这一策略的可行性，该团队以流感报告病毒PR8-NS-Gluc为出发点，通过在外源修饰目的节段NS的3’-NCR引入启动子增强突变CE1（G3A/C8U）进行平衡补偿，成功实现了重组报告病毒的定向优化；目标报告病毒PR8-NS^CE1-Gluc的复制能力和毒力均显著增强，且报告基因的相对表达水平增益10余倍。

萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，Fluc）具有发光长效、稳定、发光波长组织穿透性强、底物给予操作简便（腹腔给予）等优势，是小动物活体成像报告基因的最佳选择之一。然而Fluc基因长达1.65kb，其插入修饰严重破坏IAV目的节段的复制能力和多节段平衡；上述G3A/C8U突变不足以补偿Fluc插入导致的多节段基因组失衡。为了解决该问题，团队进一步优选了CE2（G3A/U5C/C8U）作为补偿突变，CE2较CE1具有更强的启动子增强能力；最终，团队成功构建了稳定携带Fluc基因的重组流感报告病毒PR8-NS^CE2-Fluc，进而基于该报告病毒成功构建了稳健的流感小鼠活体成像模型（图1）。

图1.基于Fluc的流感小鼠活体成像模型

山东中医药大学中医药创新研究院博士研究生赵秀娟为论文第一作者，中药抗病毒青创团队杜瑞坤副教授和崔清华副教授为论文共同通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金、山东省重点研发计划的资助。

原文链接：Zhao X, Lin X, Li P, Chen Z, Zhang C, Manicassamy B, Rong L, Cui Q, Du R. 2022. Expanding the tolerance of segmented influenza A virus genome using a balance compensation strategy. PLoS Pathog, 18: e1010756.https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010756